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骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究
时间:2015年07月05日信息来源:本站原创点击: 加入收藏 】【 字体:

骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究  

徐刚 夏维 邹晓峰 张国玺 薛义军 刘全亮 

(已发表于中华实验外科杂志 2015, 32(6): 1252-1255)

【摘要】 目的 通过观察特发性草酸钙结石(ICS)患者肾组织中骨桥蛋白(OPNmRNA和蛋白表达水平及尿液中骨桥蛋白(OPN)浓度,探讨OPNICS形成中的作用。方法 选取我院20131月至20141月因患肾无功能行肾切除术ICS患者肾组织标本34例为实验组;同期行根治性肾切除术患者远癌正常肾组织标本38例作为对照组;选取19例健康体检正常人为正常组。实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法Western blot法及免疫组织化学法分别检测实验组和对照组肾组织中OPN mRNA及蛋白的表达;酶联免疫吸附(ELISA)测定实验组、对照组和正常组尿液中OPN浓度。结果 实验组肾组织OPN mRNA 及蛋白相对表达量(2.040±1.2000.776 ± 0.071)均高于对照组(2.590±0.9100.449 ± 0.085P<0.05);但实验组尿液中OPN蛋白浓度[1.052 ± 0.229mg/L]均低于对照组[1.579 ± 0.256mg/L]和正常组[(1.498 ± 0.155mg/LP<0.05]结论 肾小管上皮细胞OPN mRNA和蛋白的过表达及尿液中OPN浓度的降低可能是ICS患者肾结石形成的重要原因。

【关键词】骨桥蛋白;特发性草酸钙结石;结石成因

Investigation of association between osteopontin and the formation of idiopathic calcium oxalate stone  Xu Gang, Xia Wei, Zou Xiaofeng,Zhang Guoxi, Xue Yijun, Liu Quanliang. Department of Urology, First Affiliated Hospital of Gannan MedicalUniversity, Ganzhou, Jiangxi, 341000, China

Corresponding author:Zhang Guoxi, Email:gyfyurology@126.com          

AbstractObjective  To investigate the role of osteopontin(OPN) in the formation of idiopathic calcium oxalate stone (ICS) by detecting OPN transcription and translation level in the renal tissue and the urine concentration of OPN in ICS patients. Methods  From January 2013 to January 2014, 34 cases of no-function kidneys were collected after the nephrectomy as the case group, 38 cases of normal renal tissues far away from the tumor as the control group after the radical nephrectomy, and 19 healthy persons as the normal group in our hospital. The expression of OPN mRNA and protein in the tissues of kidney were detected by Real-time polymerase chain reaction, Western blot and immunohistochemistry, respectively. The concentration of OPN in the urine of the groups was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results  The level of OPN mRNA and protein in the renal tissues of the case group(2.040±1.2000.776 ± 0.071) were higher than that of control group (2.590±0.9100.449 ± 0.085P<0.05). The concentration of OPN in the urine of the patients in the case group [1.052 ± 0.229mg/L]was lower than that of control group [1.579 ± 0.256mg/L]and normal group[(1.498 ± 0.155mg/LP < 0.05].Conclusions  The over-expression of OPN in the renal tissue and the low concentration of OPN in the urine may play an important role in the formation of ICS.

Key wordsOsteopontinIdiopathic calcium oxalate stoneStone causes

泌尿系结石是泌尿外科常见疾病,其中以草酸钙结石为主,临床上绝大多数草酸钙结石是特发性草酸钙结石(ICS)。近年来骨桥蛋白(OPN)在结石形成中的作用机制成为该领域研究的热点,但现有研究多局限在动物及体外实验,体内实验鲜有报道[1-3]。本研究通过检测ICS患者OPN表达变化及其尿液中OPN浓度变化,探讨OPNICS形成的相关性。

材料与方法

1.       一般资料:选取我院20131月至20141月因患肾无功能行手术切除的34ICS患者(均经结石成分分析确认)肾组织标本为实验组,其中男16例、女18例,年龄13~73岁,平均年龄为(50.7 ± 0.6岁;收集同期38例行根治性肾切除术患者的远癌正常肾组织标本(均经病理分析证实)为对照组,其中男16例、女22例,年龄40~77岁,平均年龄为(50.1 ± 0.4岁。同期选择19例健康体检正常人为正常组。另收集实验组、对照组和正常组尿液标本。本研究获赣南医学院第一附属医院伦理委员会批准。

实验组病例入选标准:

ICS患者;②均具有完整的临床、病理资料;③均无相关可能影响OPN表达的肾脏疾病且未曾服用相关药物;④获得患者及家属知情同意。

实验组病例排除标准:

遗传性草酸钙结石、甲状旁腺功能亢进、高尿酸血症、痛风、慢性胃肠疾病、尿路畸形、慢性肾功能衰竭等患者。

对照组病例入选标准:

    同期因肾肿瘤行根治性肾切除术;②既往均无结石及家族史,且经B超、尿路平片(KUB)、静脉尿路造影(IVU)或计算机体层成像(CT)等检查排除泌尿系结石;③均具有完整的临床、病理资料;④均无相关可能影响OPN表达的肾脏疾病且未曾服用相关药物;⑤获得患者及家属知情同意。

对照组病例排除标准:

既往有尿石症病史或一级、二级亲属有尿石症病史者。

2. 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测ICS患者和正常人肾组织中OPNmRNA表达:提取细胞总RNA,按Invitrogen公司提供反转录试剂盒说明书进行操作。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。OPN基因上游引物序列:5´-GGCACATTCCGGGACAGAGAGAA-3´,下游引物序列:5´-CCGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3´,扩增产物长度为245 bpGAPDH上游引物序列:5´-CCGGTTTACCCATGTGGTGCCTC-3´,下游引物序列:5´-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3´,扩增产物长度为320 bpPCR 扩增条件如下:95变性10min 95 30s60 1min7250s72延伸5min,共36个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定,凝胶成像分析仪成像,图像密度扫描行半定量分析。采用ΔΔCT法计算基因相对表达量。

3. 蛋白质印迹(Western blot)法检测ICS患者和正常人肾组织中OPN蛋白表达:裂解细胞提取蛋白,10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 分离蛋白质,4℃,110 V 转至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入一抗(稀释浓度为1500)4孵育过夜,用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS+0.5% 吐温(Tween)洗涤后,加入11000 二抗室温孵育1 hTBS+0.5% Tween洗膜次。电化学发光(ECL)显色,用图像分析仪测定条带的灰度值。

4. 免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法检测ICS患者和正常人肾组织中OPN蛋白表达及其部位:取组织蜡块制成5um的切片,60烤片并行常规二甲苯脱蜡、酒精梯度脱水后再按SP试剂盒(购于北京中衫金桥公司)说明书操作。苏木素复染后常规逐级酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜观察并照相。设置阳性和阴性对照,阳性对照切片由我院病理科提供,磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。结果判定:OPN以肾小管上皮细胞胞质着色为主,呈棕黄色至棕褐色为阳性染色。在高倍镜下(×400)对细胞反应按以下标准评分:无着色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;阳性范围:<5%为0分,5~5%为1分,26~50%为2分,5l~75%为3分,>75%为4分。两项结果相加<2分为阴性(-)2~3分为弱阳性(+)4~5分为中度阳性(++)6~7分为强阳性(+++)

5.       酶联免疫吸附(ELISA检测ICS和肾癌患者及正常人尿液中OPN蛋白含量:取各组24h新鲜尿液9ml,低温离心取上清液1ml适当稀释后将样品加于酶标板上OPN ELISA试剂盒(购于上海西唐生物科技有限公司)说明操作,根据标本的吸光度值,测得尿液中OPN浓度

6.       统计分析:应SPSS14.0软件进行统计学处理,免疫组化结果采用x2检验精确计算法分析组间差异,Real-time PCRWestern blotELISA法检测结果用均数±标准差( 骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究± s表示,两组数据统计学分析采用两个独立样本的检验,三组数据统计学分析采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

结果 

1.     SP法检测OPN蛋白表达

OPN主要表达于远端肾单位,在Helen袢升支粗段呈强表达(1)ICS患者肾组织中OPN阳性表达率为76.5(26/34),对照组肾组织中OPN阳性表达率为42.1(16/38),两组比较差异有统计学意义(P<0.05,图2)

2.     Real-time PCR法检测肾组织中OPN mRNA的表达情况

OPN mRNA在实验组和对照组肾组织中ΔCT值分别为2.040±1.2002.590±0.910。实验组肾组织中OPN mRNA的表达高于对照组(P<0.05)。根据计算公式2-ΔΔCT=OPN,在ICS患者肾组织中表达/对照组肾组织中表达,OPNICS患者肾组织中的相对表达量是对照组的1.46倍。

3.     Western blot法检测肾组织中OPN蛋白的表达情况

软件分析仪上测得的OPN条带与磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH条带的灰度比值表示各组肾组织的蛋白相对表达量(3)。实验组和对照组肾组织中OPN平均相对含量分别为0.776±0.0710.449±0.085,两组差异有统计学意义(P0.01)。

4.     ELISA法检测尿液中OPN蛋白浓度

根据不同浓度的标准品溶液测得的光密度(OD)值绘制标准曲线。实验组、对照组、正常组尿液OPN平均浓度分别为[1.052±0.229mg/L][(1.579±0.256) mg/L][(1.498 ±0.155) mg/L]。单因素方差分析显示,3组比较差异有统计学意义(P0.01);实验组和对照组、实验组与正常组相比,差异有统计学意义(P0.01)。对照组与正常组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

讨论

OPN是一带负电荷的多功能磷酸化糖蛋白,广泛分布于多种组织中,如骨、肾、胎盘、蜕膜等,参与机体不同病理生理反应。研究表明,OPN与泌尿系结石的形成关系密切[1-3]

本研究中,我们在mRNA和蛋白水平上检测了ICS患者肾组织中OPN的表达情况Real-time PCRWestern blot结果表明,ICS患者肾组织中OPN表达高于对照组P<0.05)。免疫组化结果表明,ICS患者肾组织中OPN阳性表达率高于对照组(P<0.05)。因此,转录水平及翻译水平结果均提示,ICS患者肾组织中OPN表达明显上调。

本研究结果中OPN基因和蛋白表达水平上调与ICS形成之间的关系存在两种可能:其一,肾组织中OPN高表达后可能促进了ICS的形成。其具体过程可能是OPN通过促进结石晶体与肾远端小管上皮细胞的黏附,导致肾小管上皮细胞草酸钙结晶沉积增多[4-6];其二,草酸钙晶体刺激肾小管上皮细胞后导致ICS患者肾小管上皮细胞中OPN基因和蛋白表达上调。席启林等[1]研究表明,钙刺激肾上皮细胞后,OPN基因和蛋白表达水平明显上调,细胞分泌OPN也明显增加。Khan[7]通过乙二醇诱导大鼠高草酸尿症,发现大鼠肾脏中OPN 表达量增强。关晓峰等[3]也发现尿液草酸浓度升高前,骨桥蛋白无明显表达;尿液草酸浓度升高后,骨桥蛋白表达逐渐增强。

目前认为由远曲小管、集合管及髓袢等分泌的OPN在尿液中有抑制结石形成的作用[8,9],主要表现在OPN抑制草酸钙结晶的成核和黏附[10],以及尿液中的OPN可促进COM向黏附力较低的二水草酸钙(COD)转化,从而增加COD的排泄[2,11]本研究结果表明,ICS患者尿液中OPN浓度较正常人低,提示ICS结石形成可能与其尿液中OPN的浓度下降后致其抑制结石形成的作用减弱有关。究其原因,可能为OPN本身参与结石形成并作为结石的主要有机成分致其尿液浓度下降。

本研究结果表明,肾小管上皮细胞OPN mRNA和蛋白的过表达及尿液中OPN浓度的降低可能是ICS患者肾结石形成的重要原因。其具体机制尚待进一步研究。

参考文献

[1]     席启林刘喆侯建全骨桥蛋白在高钙促进大鼠肾上皮细胞与草酸钙晶体黏附中的作用 [J]. 中华实验外科杂志, 2014, 31(8): 1762-1765.

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[7]     Khan SR, Johnson JM, Peck AB, et al. Expression of osteopontin in rat kidneys: induction during ethylene glycol induced calcium oxalate nephrolithiasis [J]. J Urol, 2002, 168(3): 1173-1181.

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[11]  Thurgood LA, Sorensen ES, Ryall RL. The effect of intracrystalline and surface-bound osteopontin on the degradation and dissolution of calcium oxalate dihydratecrystals in MDCKII cells [J]. Urol Res, 2012, 40(1): 1-15.


 

 

 骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究

a:阴性,b:弱阳性,c:中度阳性,d:强阳性

 骨桥蛋白在肾组织的表达(免疫组织化学染色,×200

 

 骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究注:OPN骨桥蛋白

2  免疫组化检测实验组与对照组OPN蛋白表达

 

骨桥蛋白与肾特发性草酸钙结石形成的相关性研究

Control:对照组;Experiment:实验组;OPN:骨桥蛋白;

GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶

3  Western blot法检测OPN蛋白相对表达量电泳图


(作者:佚名编辑:admin)
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